The point is ってこと. Actually, the subject of まだ機能してるってこと(だ) is 確実に分かること. たった一つ and まだ機能してるってこと are in apposition in that sentence, so the structure is 確実に分かることはたった一つ、すなわち/つまり、まだ機能してるってこと(だ). Thus, 銃 is the subject of 機能してる, and not the subject of まだ機能してるってこと(だ), therefore は can't be used there.
If it's あの銃は、まだ残ってるとしたら、機能してる(はずだ/に違いない), it's acceptable since 銃 is the subject of 機能してる(はずだ/に違いない) here, and は works well as an already-known topic between the speaker and listener because of あの even if 銃 is not mentioned previously. In other words, the modifying clause こんなに古くて、これほど使われてきた is also the key. こんなに古くて、これほど使われてきた銃は shows that the main clause is the explanation about the gun, but just まだ機能してる(はずだ/に違いない) is grammatically odd (cf. こんなに古くて、これほど使われてきた銃は、もう機能してるはずがない). This is another reason が is appropriate since the main clause is a result of a guess from the conditional こんなに古くて、これほど使われてきた銃がまだ残ってるとしたら.
By the way, my attempt is;
これほど古くて使われ続けてきた銃がまだ残っているのなら、確実に言えるのはただひとつ、まだ使えるってことだ。 だから少し敬意を持って扱え。さもないとその矛先がお前に向くことになるぞ。
Besides minor changes of wordings form the image of the speaker, I chose the -nara conditional since this can express a real fact other than a pure "if".